標準編號:	GB 5009.284-2021
中文名稱:	食品安全國家標準 食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的測定
英文名稱:	National food safety standard - Determination of vanillin, 3,4-Dimethoxybenzaldehyde, 3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyde and Coumarin in foods
中標分類:	X04    基礎標準與通用方法
行業分類:	GB    國家標準
發布機構:	中華人民共和國國家衛生健康委員會 國家市場監督管理總局
發布日期:	2021-09-07
實施日期:	2022-3-7
標準狀態:	valid
翻譯語言:	英文
文件格式:	PDF
中文字符數:	17000 字
翻譯價格(元):	1035.0
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Codeofchina.com is in charge of this English translation. In case of any doubt about the English translation, the Chinese original shall be considered authoritative. National food safety standard - Determination of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin in food 1 Scope This standard specifies the method for the determination of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin in food. This standard is applicable to the determination of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin in formula foods/ complementary foods for infants and young children, pastry, confection, milk and dairy products, beverage and wheat flour. Method I Liquid chromatographic method 2 Principle Add water to the sample and mix them up; extract the mixture in an ultrasonic way after adding acetonitril; separate it by liquid chromatography; detect by UV detector or diode array detector; and quantify them by the external standard method. 3 Reagents and materials Unless otherwise specified, analytically-pure reagents and Class-I water specified in GB/T 6682 are used for the purpose of this method. 3.1 Reagents and materials 3.1.1 Acetonitrile (CH3CN): chromatographically pure. 3.1.2 Methanoic acid (HCOOH): chromatographically pure. 3.1.3 Methanol (CH3OH): chromatographically pure. 3.1.4 Sodium chloride (NaCl). 3.1.5 Concentrated hydrochloric acid (HCl): 12mol/L. 3.1.6 Organic-phase microporous membrane: 0.45μm. ? 3.2 Preparation of reagents 3.2.1 0.1% formic acid-methanol solution: dissolve 1mL of formic acid in methanol and dilute to 1,000mL; freshly prepare before use. 3.2.2 Hydrochloric acid solution (1mol/L): pipette 8.33mL of concentrated hydrochloric acid, dissolve it in water and dilute the solution to 100mL; freshly prepare before use. 3.2.3 Methanol-water solution (4+1): mix methanol and water at a ratio of 4:1 (volume ratio). 3.2.4 0.5% formic acid solution: dissolve 5mL of formic acid in water and dilute to 1,000mL; freshly prepare before use. 3.3 Standard substance 3.3.1 Vanillin standard sample (C8H8O3, CAS No.: 121-33-5): purity ≥98%, or its standard sample certified by the state and issued with the reference material certificate. 3.3.2 Methyl vanillin standard sample (C9H10O3, CAS No.: 120-14-9): purity ≥98%, or its standard sample certified by the state and issued with the reference material certificate. 3.3.3 Ethyl vanillin standard sample (C9H10O3, CAS No.: 121-32-4): purity ≥98%, or its standard sample certified by the state and issued with the reference material certificate. 3.3.4 Cumarin standard sample (C9H6O2, CAS No.: 91-64-5): purity ≥97%, or its standard sample certified by the state and issued with the reference material certificate. 3.4 Preparation of standard solution 3.4.1 Standard stock solutions (1,000mg/L): accurately weigh out 10mg (accurate to 0.1mg) of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin respectively, place them in 10mL volumetric flasks respectively, dissolve to the scale with 0.1% formic acid-methanol solution, and mix them up. Transfer the solutions to a brown glass container and store at -18℃ away from light; use them within the storage period of 8 months. 3.4.2 Mixed intermediate standard solutions (10mg/L): pipette 1.00mL of the standard stock solutions (1,000mg/L) of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin respectively, pour them into 100mL volumetric flasks respectively, add 0.1% formic acid-methanol solution to the scale, and mix them up. Transfer the solutions to a brown glass container and store at -18℃ away from light; use them within the storage period of 3 months. ? 3.4.3 Mixed standard series working solutions: pipette 0.2mL, 1.0mL and 5.0mL of mixed intermediate standard solution (10mg/L) respectively into a 10mL volumetric flask, and pipette 0.2mL, 0.5mL and 1mL of standard stock solution (1,000mg/L) of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin respectively into a 10mL volumetric flask, add methanol-water solution to the scale and mix them up. The mixed standard series working solutions shall have concentrations of 0.2mg/L, 1.0mg/L, 5.0mg/L, 20.0mg/L, 50.0mg/L and 100.0mg/L respectively; freshly prepare before use. 4 Apparatuses 4.1 Liquid chromatograph: equipped with diode array detector or ultraviolet detector. 4.2 Balances: with sensitivity of 0.1mg and 0.01g, respectively. 4.3 Vortex mixer. 4.4 Centrifuge. 4.5 Nitrogen evaporator. 4.6 Ultrasonic generator. 5 Analytical steps 5.1 Sample preconditioning 5.1.1 Sample preparation Shake the liquid samples well; directly use the homogeneous semi-solid or powdery solid sample to extract the specimen (5.1.2); homogenize or crush evenly samples of other states. 5.1.2 Specimen extraction 5.1.2.1 Formula milk powder and complementary foods for infants and young children Weigh 1.00g of the sample, add 10mL of water and 480μL of hydrochloric acid solution, shake it with a vortex mixer for 1min; add 20mL of acetonitrile, shake it with a vortex mixer for 1min, apply ultrasonic extraction for 30min, then add 5g of sodium chloride, shake it with a vortex mixer for 2min, centrifuge it at 8,000r/min for 5min; take the supernatant into a glass test tube, blow it with nitrogen at 40℃ until it is nearly dry; accurately add 1.0mL of methanol-water solution to dissolve the residue; filter it through a 0.45μm microporous membrane, and be ready to test. 5.1.2.2 Pastry, confection, milk and dairy products and beverage Weigh 1.00g of the specimen, add 5mL of water (if it is gum-based confectione, add 10mL of water and dissolve it in a 50℃ water bath), shake it with a vortex mixer for 1min; add 20mL of acetonitrile, shake it with a vortex mixer for 1min, and apply ultrasonic extraction for 30min; add 5g of sodium chloride, shake it with a vortex mixer for 2min, centrifuge it at 8,000r/min for 5min (if the sample is high-fat pastry, apply freezing centrifugation at 8,000r/min); take the supernatant into a glass test tube, blow it with nitrogen at 40℃ until it is nearly dry; accurately add 1.0mL of methanol-water solution to dissolve the residue; filter it through a 0.45μm microporous membrane, and be ready to test.

1 Scope Method I Liquid chromatographic method 2 Principle 3 Reagents and materials 4 Apparatuses 5 Analytical steps 6 Calculation (expression) of analytic result 7 Precision 8 Miscellaneous Method II Liquid chromatography-mass spectrography (LC-MS)/ Mass spectrometry (MS) 9 Principle 10 Reagents and materials 11 Apparatuses 12 Analytical steps 13 Calculation (expression) of analytic result 14 Precision 15 Miscellaneous Method III Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MC) 16 Principle 17 Reagents and materials 18 Apparatuses 19 Analytical steps 20 Calculation (expression) of analytic result 21 Precision 22 Miscellaneous Annex A Liquid chromatograms of vanillin, methyl vanillin, ethyl vanillin and cumarin Annex B GC-MS/MS characteristic ion chromatograms of the four compounds with corresponding deuteration isotope internal standard solutions Annex C GC-MS/MS characteristic ion scanning chromatograms and mass spectrograms of the four compounds with corresponding deuteration isotope internal standard solutions

食品安全國家標準 食品中香蘭素、甲基香蘭素、 乙基香蘭素和香豆素的測定 1 范圍 本標準規定了食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的測定方法。 本標準適用于嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、糕點、糖果、乳及乳制品、飲料、小麥粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的測定。 第一法 液相色譜法 2 原理 試樣加水混勻后，加入乙腈超聲提取，經液相色譜分離，紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。 3 試劑和材料 除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB／T 6682規定的一級水。 3.1 試劑與材料 3.1.1 乙腈(CH3CN)：色譜純。 3.1.2 甲酸(HCOOH)：色譜純。 3.1.3 甲醇(CH3OH)：色譜純。 3.1.4 氯化鈉(NaCl)。 3.1.5 濃鹽酸(HCl)：12 mol／L。 3.1.6 微孔濾膜：0.45μm，有機相型。 3.2 試劑配制 3.2.1 0.1％甲酸甲醇溶液：吸取1 mL甲酸溶于甲醇并稀釋至1000 mL，臨用現配。 3.2.2 鹽酸溶液(1mol／L)：吸取8.33 mL濃鹽酸，溶于水并稀釋至100 mL，臨用現配。 3.2.3 甲醇-水溶液(4＋1)：將甲醇和水按4:1(體積比)混合均勻。 3.2.4 0.5％甲酸溶液：吸取5 mL甲酸，溶于水并稀釋至1000 mL，臨用現配。 3.3 標準品 3.3.1 香蘭素標準品(C8H8O3，CAS號：121-33-5)：純度≥98％，或經國家認證并授予標準物質證書的標準品。 3.3.2 甲基香蘭素標準品(C9H10O3，CAS號：120-14-9)：純度≥98％，或經國家認證并授予標準物質證書的標準品。 3.3.3 乙基香蘭素標準品(C9H10O3，CAS號：121-32-4)：純度≥98％，或經國家認證并授予標準物質證書的標準品。 3.3.4 香豆素標準品(C9H6O2，CAS號：91-64-5)：純度≥97％，或經國家認證并授予標準物質證書的標準品。 3.4 標準溶液配制 3.4.1 標準儲備液(1 000 mg／L)：準確稱取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素各10 mg(精確至0.1 mg)，分別置于10 mL容量瓶中，用0.1％甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，混勻。將溶液轉移至棕色玻璃容器內，－18℃下避光保存，保存期8個月。 3.4.2 標準混合中間液(10 mg／L)：吸取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的標準儲備液(1 000 mg／L)各1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加0.1％甲酸甲醇定容至刻度，混勻。將溶液轉移至棕色玻璃容器中，－18℃下避光保存，保存期3個月。 3.4.3 標準混合系列工作液：分別吸取標準混合中間液(10 mg／L)0.2 mL、1.0 mL、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，另分別吸取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素的標準儲備液(1000 mg／L)0.2 mL、0.5 mL和1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇-水溶液定容至刻度，混勻。標準混合系列工作液的濃度分別為0.2 mg／L、1.0 mg／L、5.0 mg／L、20.0 mg／L、50.0 mg／L、100.0 mg／L，臨用現配。 4 儀器和設備 4.1 液相色譜儀：配有二極管陣列或紫外檢測器。 4.2 天平：感量分別為0.1 mg和0.01 g。 4.3 渦旋混合器。 4.4 離心機。 4.5 氮氣濃縮裝置。 4.6 超聲波發生器。 5 分析步驟 5.1 樣品前處理 5.1.1 試樣制備 液態試樣搖勻；基質均勻的半固態試樣和粉狀試樣直接用于5.1.2試樣提??；其他試樣需勻漿或粉碎均勻。 5.1.2 試樣提取 5.1.2.1 嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品 稱取1.00 g試樣，加入10 mL水和480μL鹽酸溶液，渦旋振蕩1 min，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min后，加入5g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，8 000 r／ min離心5 min，取上清液至玻璃試管，40℃氮吹至近干，準確加入1.0 mL甲醇-水溶液溶解殘渣，過0.45μm微孔濾膜后，待測。 5.1.2.2 糕點、糖果、乳及乳制品、飲料 稱取1.00 g試樣，加入5 mL水(膠基糖果加入10 mL水，50℃水浴溶解)，渦旋振蕩1 min，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min后，加入5 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，8000r／ min離心5 min(對于含油脂高的糕點樣品，采取冷凍離心，8 000 r／ min)，取上清液至玻璃試管，40℃氮吹至近干，準確加入1.0 mL甲醇-水溶液溶解殘渣，過0.45μm微孔濾膜后，待測。 5.1.2.3 小麥粉 稱取1.00g試樣，加入10 mL水和240μL鹽酸溶液，渦旋振蕩1 min，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min后，加入5g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，8000r／ min離心5 min，取上清液至玻璃試管，40℃氮吹至近干，準確加入1.0 mL甲醇-水溶液溶解殘渣，過0.45μm微孔濾膜后，待測。 5.2 儀器參考條件 5.2.1 色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm(內徑)，5μm(填料粒徑)或相當者。 5.2.2 柱溫：30℃。 5.2.3 進樣量：10μL。 5.2.4 檢測波長：279nm。 5.2.5 流速：1.0 mL／ min。 5.2.6 流動相 A相：0.5％甲酸溶液； B相：乙腈。 梯度洗脫見表1。 表1 梯度洗脫程序 時間／min A／％ B／％ 5.3 標準曲線的制作 將標準混合系列工作液分別注入液相色譜儀中，測定相應的峰面積，以標準系列工作液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素標準溶液的色譜圖參見附錄A中圖A.1。 5.4 試樣溶液的測定 將試樣溶液注入液相色譜儀中，得到峰面積，根據標準曲線得到試樣溶液中被測化合物的濃度。 6 分析結果的表述 試樣中被測化合物的含量按式(1)計算。 (1) 式中： Xi——試樣中被測化合物的含量，單位為毫克每千克( mg／kg)； ρ——由標準曲線得到的試樣溶液中被測化合物的濃度，單位為微克每毫升(μg／ mL)； V——試樣最終定容體積，單位為毫升(mL)； m——試樣的取樣量，單位為克(g)。 1 000——換算系數。 注：計算結果需扣除空白值，保留小數點后兩位數字。 7 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15％。 8 其他 本方法的檢出限均為0.07 mg／kg，定量限均為0.20 mg／kg。 第二法 液相色譜-質譜／質譜法 9 原理 試樣加水混勻后，經乙腈超聲提取，提取液經固相萃取柱凈化后，液相色譜-質譜／質譜儀測定，內標法定量。 10 試劑和材料 除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB／T 6682規定的一級水。 10.1 試劑及材料 10.1.1 乙腈(CH3CN)：色譜純。 10.1.2 甲酸(HCOOH)：色譜純。 10.1.3 甲醇(CH3OH)：色譜純。 10.1.4 氯化鈉(NaCl)。 10.1.5 濃鹽酸(HCl)：12mol／L。 10.1.6 含極性基團的反相聚合物固相萃取柱：60 mg、3 mL，或相當者。含極性基團的反相聚合物固相萃取柱吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按照一定比例聚合成的大孔聚合物。使用前用3 mL甲醇、3 mL水活化。 10.1.7 微孔濾膜：0.22μm，有機相型。 10.2 試劑配制 10.2.1 0.1％甲酸甲醇溶液：吸取1 mL甲酸溶于甲醇并稀釋至1000 mL，臨用現配。 10.2.2 鹽酸溶液(1 mol／L)：吸取8.33 mL濃鹽酸，溶于水并稀釋至100 mL，臨用現配。 10.2.3 甲醇-水溶液(4＋1)：將甲醇和水按4:1(體積比)混合均勻。 10.2.4 0.5％甲酸溶液：吸取5 mL甲酸，溶于水并稀釋至1000 mL，臨用現配。 10.3 標準品 10.3.1 香蘭素標準品(C8H8O3，CAS號：121-33-5)：純度≥98％，或經國家認證并授予標準物質證書的標準品。 10.3.2 甲基香蘭素標準品(C9H10O3，CAS號：120-14-9)：純度≥98％，或經國家認證并授予標準物質證書的標準品。 10.3.3 乙基香蘭素標準品(C9H10O3，CAS號：121-32-4)：純度≥98％，或經國家認證并授予標準物質證書的標準品。 10.3.4 香豆素標準品(C9H6O2，CAS號：91-64-5)：純度≥97％，或經國家認證并授予標準物質證書的標準品。 10.3.5 D3-香蘭素標準品(C8H5D3O3，CAS號：74495-74-2)：純度≥98％。 10.3.6 D3-甲基香蘭素標準品(C9H7D3O3，CAS號：143318-06-3)：純度≥98％。 10.3.7 D5-乙基香蘭素標準品(C9H5D5O3，CAS號：1335401-74-5)：純度≥98％。 10.3.8 D4-香豆素標準品(C9H2D4O2，CAS號：185056-83-1)：純度≥98％。 10.4 標準溶液配制 10.4.1 標準儲備液(1000 mg／L)：同3.4.1。 10.4.2 標準混合中間液(10 mg／L)：同3.4.2。 10.4.3 內標儲備液(1000 mg／L)：準確稱取D3-香蘭素、D3-甲基香蘭素、D5-乙基香蘭素、D4-香豆素各10 mg(精確至0.1 mg)，分別置于10 mL容量瓶中，用0.1％甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，混勻將溶液轉移至棕色玻璃容器內，－18℃下避光保存，保存期8個月。 10.4.4 內標混合中間液(10 mg／L)：吸取D3-香蘭素、D3-甲基香蘭素、D5-乙基香蘭素、D4-香豆素的標準儲備液(1 000 mg／L)各1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加0.1％甲酸甲醇溶液定容至刻度，混勻。將溶液轉移至棕色玻璃容器內，－18℃下避光保存，保存期3個月。 10.4.5 標準及內標混合系列工作液：分別吸取標準混合中間液(10 mg／L)0.05 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL和內標混合中間液(10 mg／L)0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇-水溶液定容至刻度，混勻。標準及內標混合系列工作液的濃度分別為0.05 mg／L、0.2 mg／L、0.5 mg／L、1.0 mg／L、2.0 mg／L，內標的濃度均為0.1 mg／L。臨用現配。 11 儀器和設備 11.1 液相色譜串聯四極桿質譜儀：配電噴霧離子源。 11.2 天平：感量為0.1 mg和0.01g。 11.3 渦旋混合器。 11.4 離心機。 11.5 高速冷凍離心機。 11.6 氮氣濃縮裝置。 11.7 超聲波發生器。 11.8 固相萃取裝置。 12 分析步驟 12.1 樣品前處理 12.1.1 試樣制備 液態試樣搖勻；基質均勻的半固態試樣和粉狀試樣直接用于12.1.2試樣提??；膠基質糖果粉碎，攪勻；其他試樣需勻漿或粉碎均勻。 12.1.2 試樣提取 12.1.2.1 嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品 稱取1.00g試樣，加入10μL內標混合中間液，加入10 mL水和480μL鹽酸溶液，渦旋振蕩1 min，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min后，加入5g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，8 000 r／min離心5 min，取上清液至玻璃試管，待凈化。 12.1.2.2 糕點、糖果、乳及乳制品、飲料 稱取1.00g試樣，加入10μL內標混合中間液，加入5 mL水(膠基糖果加入10 mL水，50℃水浴溶解)，渦旋振蕩1 min，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min后，加入5g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，8 000 r／min離心5 min(對于含油脂高的糕點樣品，采取冷凍離心，8 000 r／min)，取上清液至玻璃試管，待凈化。 12.1.2.3 小麥粉 稱取1.00g試樣，加入10μL內標混合中間液，加入10 mL水和240μL鹽酸溶液，渦旋振蕩1 min，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min后，加入5g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，8 000 r／min離心5 min，取上清液至玻璃試管，待凈化。 12.1.3 試樣凈化 將12.1.2中得到的上清液于40℃氮吹至近干，加入1 mL甲醇溶解殘渣，用水定容至10 mL，使該樣液以小于1 mL／min的流速通過固相萃取柱。樣液全部流出后，用5 mL水淋洗，負壓抽干，10 mL甲醇-水溶液洗脫，負壓抽干，收集洗脫液，40℃氮吹至近干，準確加入1 mL甲醇-水溶液溶解殘渣，過0.22μm微孔濾膜后，待測。 12.2 儀器參考條件 12.2.1 液相色譜參考條件 12.2.1.1 色譜柱：C18柱，100mm×2.1mm(內徑)，1.8μm(填料粒徑)，或相當者。 12.2.1.2 進樣量：5μL。 12.2.1.3 柱溫：30℃。 12.2.1.4 流速：0.3 mL／min。