Biological evaluation of medical devices -
Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity
1 Scope
This part of GB/T 16886 specifies strategies for risk estimation, selection of hazard (sources) identification tests and risk management, with respect to the possibility of the following potentially irreversible biological effects arising as a result of exposure to medical devices:
- genotoxicity;
- carcinogenicity;
- reproductive and developmental toxicity.
This part is applicable when the need to evaluate a medical device for potential genotoxicity, carcinogenicity, or reproductive toxicity has been established.
Note: Guidance on selection of tests is provided in ISO 10993-1.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10993-1 Biological evaluation of medical devices - Part 1 : Evaluation and testing within a risk management process
ISO 10993-2 Biological evaluation of medical devices - Part 2 : Animal welfare requirements
ISO 10993-6 Biological evaluation of medical devices - Part 6 : Tests for local effects after implantation
ISO 10993-12 Biological evaluation of medical devices - Part 12 : Sample preparation and reference materials
ISO 10993-18 Biological evaluation of medical devices - Part 18 : Chemical characterization of materials
OECD 414 Prenatal Development Toxicity Study)
OECD 415 One-Generation Reproduction Toxicity Study
OECD 416 Two-Generation Reproduction Toxicity
OECD 421 Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test
OECD 451 Carcinogenicity Studies
OECD 453 Combined Chronic Toxicity/Carcinogenicity Studies
OECD 471 Bacterial Reverse Mutation Test
OECD 473 In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test
OECD 476 In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests using the Hprt and Xprt genes
OECD 487 In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 10993-1, ISO 10993-12 and the following apply.
3.1
carcinogenicity test
test to determine the carcinogenic potential of medical devices, materials, and/or extracts using multiple exposures for a major portion of the life span of the test animal
3.2
energy-depositing medical device
device intended to exert its therapeutic or diagnostic effect by the delivery of electromagnetic radiation, ionising radiation or ultrasound
Note: This does not include medical devices that deliver simple electrical current, such as electrocautery medical devices, pacemakers or functional electrical stimulators.
3.3
genotoxicity test
test using mammalian or non-mammalian cells, bacteria, yeasts, fungi or whole animals to determine whether gene mutations, changes in chromosome structure, or other DNA or gene changes are caused by the test samples
3.4
maximum tolerated dose; MTD
maximum dose that a test animal can tolerate without any adverse effects
3.5
reproductive and developmental toxicity test
test to evaluate the potential effects of test samples on reproductive function, embryonic morphology (teratogenicity), and prenatal and early postnatal development
3.6
test sample preparation
residual, extractables, leachables or biodegradable device materials that are resuspended in a vehicle compatible with the test system
4 Requirements for test strategies
4.1 General
ISO 10993-1 indicates circumstances where the potential for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity is a relevant hazard for consideration in an overall biological safety evaluation. Testing to investigate these hazards shall be justified on the basis of a risk assessment. In determining if genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity testing of the device is warranted an assessment of risk shall address the following factors
- an analysis of the chemical constituents of the device material(s), including manufacturing process residues and degradation products or metabolites, to identify causes of concern on the basis of structure-activity relationships or previous demonstration of relevant toxicity in the chemical class,
- the mechanistic basis of the toxic response under consideration, if available,
- existing information relevant to the genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity evaluation of the medical device,
- the extent of previous use of comparable materials in relevant applications,
- consideration of residuals from the final finished device with respect to how well they are characterized and their potential biological activity (e.g. structure-activity relationships, or previous demonstration of relevant outcomes),
- exposure route,
- patient population,
- extent and duration of localized (at the site of implantation or use) and systemic exposure,
- the anticipated impact of test results (or lack of testing) on risk management judgements, and
- changes in the type or amount of residuals that the patient will be exposed to, either through an increase in device exposure, or an increase in devices size when compared to an equivalent device.
Commonly used risk assessment tools [e.g. TTC[) TTC is short for Threshold toxicological concern.])] may be helpful in evaluating these factors.
Where an analysis of the composition of device materials reveals the presence of chemical constituents that are of concern but for which inadequate toxicity data are available, consideration shall be given to testing individual chemical. Individual chemicals shall be tested in preference to compounded materials or extracts, where this would improve the risk estimate. Where testing of a device material is indicated testing shall be conducted on the final product (including sterilization if applicable), or representatives from the final products, or materials processed in the same manner as the final product (including sterilization if applicable). The decision to test, and the nature of the test sample, shall be justified and documented.
Testing may be warranted for additional states of the device such as, wear debris generated from the device or materials that cure in situ (e.g. cements, adhesives and pre-polymer mixtures) unless toxicological risk assessment determines no cause for concern from additional device/material states. For guidance on in situ curing devices see ISO 10993-12.
4.2 Additional requirements for carcinogenicity testing
For carcinogenicity testing, in addition to 4.1, the following factors shall be addressed:
- physical characteristics (e.g. particle size and shape, pore size, surface continuity, surface condition, device thickness);
- results from genotoxicity, implantation and other studies.
4.3 Additional requirements for reproductive toxicity testing
For reproductive testing, in addition to 4.1, the total direct or indirect cumulative contact duration with reproductive tissue, the embryo/foetus or the germ cells shall be addressed.
Any information from published literature on the effect of device materials on male/female reproductive organs or from subacute/chronic study on the histopathology of reproductive system should also form the basis before a full scale reproductive toxicity testing is performed.
ICS 11.100.20
CCS C 30
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 16886.23—2023/ISO 10993-23：2021
醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)
第23部分：刺激試驗(yàn)
Biological evaluation of medical devices—Part 23：Tests for irritation
(ISO 10993-23：2021，IDT)
2023-11-27發(fā)布 2024-12-01實(shí)施
國家市場監(jiān)督管理總局
國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)
發(fā)布
前言
本文件按照GB/T 1.12020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本文件是GB/T(Z)16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》的第23部分。GB/T(Z)16886已經(jīng)發(fā)布了以下部分：
——第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中的評(píng)價(jià)與試驗(yàn)；
——第2部分：動(dòng)物福利要求；
——第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)；
——第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇：
——第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)；
——第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)；
——第7部分：環(huán)氧乙烷滅菌殘留量；
——第9部分：潛在降解產(chǎn)物的定性和定量框架；
——第10部分：刺激與皮膚致敏試驗(yàn)；
——第11部分：全身毒性試驗(yàn)；
——第12部分：樣品制備與參照材料；
——第13部分：聚合物醫(yī)療器械降解產(chǎn)物的定性與定量；
——第14部分：陶瓷降解產(chǎn)物的定性與定量；
——第15部分：金屬與合金降解產(chǎn)物的定性與定量；
——第16部分：降解產(chǎn)物與可瀝濾物毒代動(dòng)力學(xué)研究設(shè)計(jì)；
——第17部分：可瀝濾物允許限量的建立；
——第18部分；風(fēng)險(xiǎn)管理過程中醫(yī)療器械材料的化學(xué)表征；
——第19部分：材料物理化學(xué)，形態(tài)學(xué)和表面特性表征；
——第20部分：醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗(yàn)原則和方法；
——第22部分：納米材料指南；
——第23 部分：刺激試驗(yàn)。
本文件等同采用ISO 10993-23：2021《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第23部分；刺激試驗(yàn)》。
請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。
本文件由國家藥品監(jiān)督管理局提出。
本文件由全國醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC 248)歸口。
引言
本文件用于評(píng)估醫(yī)療器械可能引起的刺激性接觸危險(xiǎn)。
醫(yī)療器械中所含有的某些材料已進(jìn)行過試驗(yàn)，其潛在的皮膚、黏膜刺激性已被確認(rèn)。其他一些未做過試驗(yàn)的材料及其化學(xué)成分在與人體組織接觸時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生不良作用。因此，制造商有責(zé)任在投放市場前評(píng)價(jià)器械的潛在不良作用。
醫(yī)療器械或其組件的潛在刺激性能通過體內(nèi)動(dòng)物刺激試驗(yàn)或通過經(jīng)確認(rèn)可用于醫(yī)療器械的體外刺激試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測。
GB/T 16886.2描述了為醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)進(jìn)行動(dòng)物研究的動(dòng)物福利方面的內(nèi)容，因此本文件中也強(qiáng)調(diào)了動(dòng)物研究的替代，減少和優(yōu)化的3R原則，本文件描述了通過體外試驗(yàn)或體內(nèi)試驗(yàn)來檢測醫(yī)療器械、材料或其浸提液的刺激性的試驗(yàn)。在經(jīng)適當(dāng)驗(yàn)證同樣能提供體內(nèi)試驗(yàn)獲取的相關(guān)信息時(shí)，體外試驗(yàn)優(yōu)先于體內(nèi)試驗(yàn)(見GB/T 16886.1和 GB/T 16886.2)。
傳統(tǒng)上，人體試驗(yàn)之前要先進(jìn)行小動(dòng)物試驗(yàn)以助于預(yù)測人體反應(yīng)。最近，還增加了作為輔助或替代的體外試驗(yàn)以及人體試驗(yàn)。利用重建人表皮(RhE)模型開發(fā)了用于純化學(xué)物皮膚刺激試驗(yàn)的體外試驗(yàn)。該方法被應(yīng)用于檢測醫(yī)療器械浸提液中的刺激性化學(xué)物質(zhì)。一項(xiàng)測試兩種類型RhE模型的大型比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果表明，這些模型也可用于檢測常用于制造醫(yī)療器械的高分子材料[聚氯乙烯(PVC)和硅樹脂]中浸提出的刺激性化學(xué)物質(zhì)。在檢測一些低濃度強(qiáng)刺激性化合物時(shí)，本方法與人斑貼試驗(yàn)和兔皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)相比同樣敏感。因此，刺激物檢測的逐步評(píng)價(jià)程序可以從RhE模型體外試驗(yàn)開始。
成熟的和經(jīng)驗(yàn)證的RhE模型適用于預(yù)測皮膚組織的刺激反應(yīng)。推薦探索使用其他體外替代模型來評(píng)估應(yīng)用于黏膜或眼上皮器械的潛在刺激性。
進(jìn)行這些研究用于注冊(cè)申報(bào)時(shí)遵循GLP或適用于相關(guān)國家的ISO /IEC 17025，并遵守與動(dòng)物福利有關(guān)的規(guī)則。建議在適宜的情況下對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
本文件由經(jīng)過培訓(xùn)的且有經(jīng)驗(yàn)、有適當(dāng)資格的專業(yè)人員使用，能夠解釋標(biāo)準(zhǔn)要求并能考慮與器械全部相關(guān)因素，包括器械的預(yù)期用途、由科學(xué)文獻(xiàn)的評(píng)審和先前臨床經(jīng)驗(yàn)給出的該醫(yī)療器械的當(dāng)前知識(shí)，來判定每一醫(yī)療器械的評(píng)價(jià)結(jié)果，
本文件所包括的試驗(yàn)是安全產(chǎn)品開發(fā)的重要工具。前提是它們由經(jīng)過培訓(xùn)的人員進(jìn)行試驗(yàn)并解釋試驗(yàn)結(jié)果。
本文件以諸多標(biāo)準(zhǔn)和導(dǎo)則為基礎(chǔ)，包括經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD )試驗(yàn)導(dǎo)則(TG)、美國藥典和歐洲藥典。本文件旨在作為基礎(chǔ)文件，用于選擇和實(shí)施能評(píng)價(jià)與醫(yī)用材料和器械安全性相關(guān)的刺激反應(yīng)的試驗(yàn)。
附錄A中給出了具體涉及以上試驗(yàn)材料制備的說明。附錄D中描述了幾種特殊的體內(nèi)刺激試驗(yàn)，用于非皮膚區(qū)域應(yīng)用的醫(yī)療器械。此外，附錄E提供了進(jìn)行人體皮膚刺激試驗(yàn)的信息。
GB/T(Z) 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》擬由二十一個(gè)部分構(gòu)成：
——第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中的評(píng)價(jià)與試驗(yàn)。目的是保護(hù)人類免于因使用醫(yī)療器械所產(chǎn)生的潛在生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，并在風(fēng)險(xiǎn)管理過程中描述醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)，將其作為醫(yī)療器械總體評(píng)價(jià)和開發(fā)過程的一個(gè)組成部分。
——第2部分：動(dòng)物福利要求。目的是最大限度利用科學(xué)合理的非動(dòng)物試驗(yàn)，確保用于評(píng)價(jià)醫(yī)療器械所用材料的生物學(xué)性能動(dòng)物試驗(yàn)符合認(rèn)可的倫理和科學(xué)原則。
——第3部分：遺傳毒性，致癌性和生殖毒性試驗(yàn)。目的是為已確定具有潛在的遺傳毒性，致癌性或生殖毒性的醫(yī)療器械提供評(píng)價(jià)指南和方法。
——第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇。目的是為醫(yī)療器械與血液相互作用評(píng)價(jià)提供通用要求。
——第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)。目的是為評(píng)估醫(yī)療器械體外細(xì)胞毒性提供試驗(yàn)方法。
——第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)。目的是為評(píng)估醫(yī)療器械所用生物材料植入后局部反應(yīng)提供試驗(yàn)方法。
——第7部分：環(huán)氧乙烷滅菌殘留量。目的是為經(jīng)環(huán)氧乙烷(EO)滅菌的單件醫(yī)療器械上EO及2-氯乙醇(ECH)殘留物的允許限量，EO及ECH殘留量提供檢測步驟以及確定器械是否可以出廠提供檢測方法。
——第9部分：潛在降解產(chǎn)物的定性和定量框架。目的是為系統(tǒng)評(píng)價(jià)醫(yī)療器械潛在的和已觀察到的生物降解以及生物降解研究的設(shè)計(jì)與實(shí)施提供基本原則。
——第10部分：刺激與皮膚致敏試驗(yàn)。目的是為醫(yī)療器械及其組成材料潛在刺激和皮膚致敏提供評(píng)價(jià)步驟。
——第11部分；全身毒性試驗(yàn)。目的是為評(píng)價(jià)醫(yī)療器械材料導(dǎo)致潛在不良全身反應(yīng)時(shí)提供試驗(yàn)步驟指南。
——第12部分：樣品制備與參照材料。目的是為醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)中樣品制備方法和參照材料提供選擇指南。
——第13部分：聚合物醫(yī)療器械降解產(chǎn)物的定性與定量。目的是為用于臨床的成品聚合物醫(yī)療器械模擬環(huán)境的降解產(chǎn)物定性與定量試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供通用要求。
——第14部分：陶瓷降解產(chǎn)物的定性與定量。目的是為從陶瓷材料獲取降解產(chǎn)物定量用的溶液提供方法。
——第15部分：金屬與合金降解產(chǎn)物的定性與定量。目的是為金屬醫(yī)療器械或可供臨床使用的相應(yīng)材料樣品的降解產(chǎn)物提供定性與定量試驗(yàn)設(shè)計(jì)的通用要求。
——第16部分：降解產(chǎn)物與可瀝濾物毒代動(dòng)力學(xué)研究設(shè)計(jì)。目的是提供與醫(yī)療器械相關(guān)的設(shè)計(jì)和實(shí)施毒代動(dòng)力學(xué)研究的原則。
——第17部分：可瀝濾物允許限量的建立。目的是為醫(yī)療器械可瀝濾物允許限量的建立提供方法。
——第18部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中醫(yī)療器械材料的化學(xué)表征。目的是為醫(yī)療器械成分的定性和定量(必要時(shí))以識(shí)別生物危險(xiǎn)以及估計(jì)和控制材料成分中的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)提供框架。
——第19部分：材料物理化學(xué)、形態(tài)學(xué)和表面特性表征。目的是識(shí)別與評(píng)價(jià)最終醫(yī)療器械材料的物理特性，如物理化學(xué)，形態(tài)學(xué)和表面特性(PMT)的各種參數(shù)和試驗(yàn)方法。
——第20部分：醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗(yàn)原則和方法。目的是為醫(yī)療器械潛在免疫毒性方面提供免疫毒理學(xué)綜述以及為檢驗(yàn)不同類型醫(yī)療器械的免疫毒性提供方法指南。
——第22部分；納米材料指南，日的是為包含，產(chǎn)生或由納米材料組成的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)提供指南。
——第23部分：刺激試驗(yàn)。目的是為醫(yī)療器械及其組成材料潛在刺激提供評(píng)價(jià)步驟。
醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)
第23部分：刺激試驗(yàn)
1 范圍
本文件規(guī)定了醫(yī)療器械及其組成材料潛在刺激的評(píng)估步驟：包括以下內(nèi)容：
——刺激試驗(yàn)前的考慮，包括皮膚接觸方面的計(jì)算機(jī)模擬試驗(yàn)和體外方法；
——詳細(xì)的體外和體內(nèi)刺激試驗(yàn)步驟；
——結(jié)果解釋的關(guān)鍵因素。
本文件適用于根據(jù)ISO 10993-1和ISO 10993-2對(duì)醫(yī)療器械、材料或其浸提液的潛在刺激性進(jìn)行預(yù)測和分類。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
GB/T 16886，1—2022醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中的評(píng)價(jià)和試驗(yàn)(ISO )10993-1：2018，IDT)
ISO 10993-1醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第1部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中的評(píng)價(jià)與試驗(yàn)(Biological evaluation of medical devices—Part 1：Evaluation and testing within a risk management process)
ISO 10993-2醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2部分：動(dòng)物福利要求(Biological evaluation of medical devices—Part 2：Animal welfare requirements)
注：GB/T 16886.2—2011醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2部分：動(dòng)物福利要求(ISO 10993-2：2006，IDT)
ISO 10993-9醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第9部分；潛在降解產(chǎn)物的定性和定量框架(Biological evaluation of medical devices—Part 9：Framework for identification and quantification of potential degradation products)
注：GB/T 16886.9—2022醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第9部分：潛在降解產(chǎn)物的定性和定量框架(ISO 10993-9：2019，IDT)
ISO 10993-12醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分：樣品制備與參照材料(Biological evaluation of medical devices—Part 12：Sample preparation and reference materials)
注：GB/T 16886.12—2023醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分：樣品制備與參照材料(ISO 10993-12：2021，IDT)
ISO 10993-13醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第13部分：聚合物醫(yī)療器械的降解產(chǎn)物的定性與定量(Biological evaluation of medical devices—Part 13：Identification and quantification of degradation products from polymeric medical devices)
注：GB/T 16886.13—2017醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第13部分：聚合物降解產(chǎn)物的定性與定量(ISO 10993-13：2010，IDT)
ISO 10993-14醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第14部分：陶瓷降解產(chǎn)物的定性與定量(Biological evaluation of medical devices—Part 14：Identification and quantification of degradation products from ceramics)
注：GB/T 16886.14—2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第14部分：陶瓷降解產(chǎn)物的定性與定量(ISO 10993-14：2001，IDT)
ISO 10993-15醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第15部分：金屬與合金降解產(chǎn)物的定性與定量(Biological evaluation of medical devices—Part 15：Identification and quantification of degradation products from metals and alloys)
注：GB/T 16886.15—2022醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第15部分：金屬與合金降解產(chǎn)物的定性與定量(ISO 10993-15：2019，IDT)
ISO 10993-18醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第18部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中醫(yī)療器械材料的化學(xué)表征(Biological evaluation of medical devices—Part 18：Chemical characterization of medical device materials within a risk management process)
注：GB/T 16886.18—2022醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第18部分：風(fēng)險(xiǎn)管理過程中醫(yī)療器械材料的化學(xué)表征(ISO 10993-18；2020，IDT)
ISO 14155用于人體的醫(yī)療器械臨床研究 良好臨床規(guī)范(Clinical investigation of medical devices for human subjects—Good clinical practice)
OECD 404急性皮膚刺激/腐蝕(Acute Dermal Irritation/Corrosion)
OECD 439體外皮膚刺激：重建人表皮試驗(yàn)法(In Vitro Skin Irritation：Reconstructed Human Epidermis Test Method)
3 術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本文件。
ISO 和IEC維護(hù)的用于標(biāo)準(zhǔn)化的術(shù)語數(shù)據(jù)庫，地址如下：
——IEC電子百科：http：//www.electropedia，org/；
——ISO在線瀏覽平臺(tái)：http：//www.iso.org/obp。
3.1
空白 blank
與樣品測定溶液相同方式制備但不含待測分析物的溶液。
[來源：ISO 10136-1：1993，3.8，有修改]
3.2
用量 dose
劑量 dosage
每單位體重或表面積試驗(yàn)樣品(3.14)的給予量(如質(zhì)量、體積)。
注：這兩個(gè)術(shù)語通常會(huì)交換使用(“劑量”較為常用)。
3.3
紅斑erythema
皮膚或黏膜發(fā)紅。
3.4
焦痂eschar
皮膚結(jié)痂或變色的蛻皮。
3.5
浸提液extract
在受控條件下將某一試驗(yàn)或?qū)φ詹牧吓c浸提介質(zhì)(3.16)接觸后得到的液體或懸浮液。
3.6
刺激物 irritant
引起刺激(3.7)的物質(zhì)。
3.7
刺激 irritation
一次、多次或持續(xù)與一種物質(zhì)/材料接觸所引起的局部非特異性炎癥反應(yīng)。
注：皮膚刺激是一種可逆反應(yīng)，主要以皮膚局部紅斑(3.3)(發(fā)紅)和腫脹[水腫(3.10)]為特征。
3.8
壞死 necrosis
由于損傷或疾病造成的不可逆改變直接導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。
注：組織修復(fù)會(huì)導(dǎo)致完全性功能恢復(fù)或瘢痕形成。
3.9
陰性對(duì)照 negative control
經(jīng)充分表征的材料或物質(zhì)，當(dāng)用特定試驗(yàn)方法評(píng)估時(shí)，顯示該試驗(yàn)系統(tǒng)適宜產(chǎn)生可重復(fù)的，適當(dāng)陰性的、無反應(yīng)的或最小的應(yīng)答。
注：實(shí)際操作中，陰性對(duì)照(NC)包括空白(3.1)、介質(zhì)(3.16)/溶劑和參照材料。
3.10
水腫oedema
液體向組織內(nèi)異常滲透引起的腫脹。
3.11
陽性對(duì)照 positive control
經(jīng)充分表征的材料或物質(zhì)，當(dāng)用特定試驗(yàn)方法評(píng)估時(shí)，顯示該試驗(yàn)系統(tǒng)適宜產(chǎn)生可重復(fù)的、適當(dāng)陽性的或反應(yīng)性的應(yīng)答。
3.12
皮膚腐蝕skin corrosion
應(yīng)用某一試驗(yàn)樣品(3.14)后皮膚的不可逆性損傷結(jié)果，表現(xiàn)為從表皮至真皮的明顯壞死(3.8)。
示例：混合物/化學(xué)物/試驗(yàn)樣品作用所導(dǎo)致的皮膚潰瘍(見3.15)。
3.13
試驗(yàn)材料test material
取樣供生物學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)用的材料、器械、器械的一部分或其組件。
3.14
試驗(yàn)樣品test sample
用于生物學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)或評(píng)價(jià)的醫(yī)療器械、組件、材料、法提液(3.5)或其中部分。
3.15
潰瘍 ulceration
表現(xiàn)為淺表組織缺損的開放性潰爛。
3.16
介質(zhì) vehicle
用于濕化、稀釋、懸浮、浸提或溶解試驗(yàn)物質(zhì)/材料的液體。
3.17
介質(zhì)對(duì)照vehicle control
不加試驗(yàn)材料(3.13)的浸提介質(zhì)(3.16)，置于與試驗(yàn)材料相同的容器中，并經(jīng)受與試驗(yàn)材料相同的浸提條件。
注：介質(zhì)對(duì)照(VC)的日的是評(píng)價(jià)沒提容器、浸提介質(zhì)和浸提過程可能的干擾作用。
4基本原則——逐步評(píng)價(jià)法
現(xiàn)有檢測刺激的試驗(yàn)方法特別設(shè)定為測定潛在的皮膚刺激和黏膜刺激作用，這些試驗(yàn)一般不預(yù)測其他類型的不良作用(如致敏)。歷史上刺激試驗(yàn)是在兔身上進(jìn)行的。對(duì)于植入醫(yī)療器械或外部接入醫(yī)療器械，皮內(nèi)注射試驗(yàn)更為接近實(shí)際應(yīng)用，因此用于檢測刺激作用，皮內(nèi)試驗(yàn)如7.2所示。
當(dāng)新的體外試驗(yàn)作為體內(nèi)試驗(yàn)的替代，已經(jīng)過科學(xué)驗(yàn)證符合醫(yī)療器械的使用要求，并且可以合理且切實(shí)可行地使用的時(shí)候，根據(jù)ISO 10993-2，應(yīng)考慮優(yōu)選體外試驗(yàn)。一項(xiàng)測試了兩種RhE模型的大型比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果表明，這些模型也能用于檢測常用于制造醫(yī)療器械的高分子材料[聚氯乙烯(PVC)和硅樹脂]中浸提出的化學(xué)刺激物。在檢測一些低濃度強(qiáng)刺激性化合物時(shí)，本方法與人斑貼試驗(yàn)和兔皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)相比同樣敏感。因此，應(yīng)考慮在動(dòng)物試驗(yàn)或人斑貼試驗(yàn)之前進(jìn)行這種體外刺激試驗(yàn)。
注1；提供RhE模型對(duì)在測試特定醫(yī)療器械適用性的詳細(xì)信息可能是相關(guān)的。
本文件描述了一種逐步評(píng)價(jià)法，其中應(yīng)包括下列一項(xiàng)或多項(xiàng)內(nèi)容：
a)化學(xué)表征，需要時(shí)按照ISO 10993-9、ISO 10993-13、ISO 10993-14、ISO 10993-15和ISO 10993-18規(guī)定的基本原則補(bǔ)充樣品的化學(xué)試驗(yàn)；
b)文獻(xiàn)審查，如ISO 10993-1所述，包括化學(xué)和物理特性的評(píng)價(jià)，以及任何產(chǎn)品組分以及結(jié)構(gòu)相關(guān)化學(xué)品和材料的潛在刺激性信息；
注2：計(jì)算機(jī)模擬方法如構(gòu)效關(guān)系、定量的構(gòu)效關(guān)系(QSAR)、交叉參照可能指示潛在刺激活性。
c)采用6.2～6.12中經(jīng)驗(yàn)證的RhE方法進(jìn)行體外替代試驗(yàn)；
注3：對(duì)于與預(yù)期用于特殊部位(見附錄D)，即黏膜或眼上皮的醫(yī)療器械相關(guān)的特殊刺激試驗(yàn)，RhE模型不適用。若經(jīng)證實(shí)可用于醫(yī)療器械，推薦探索使用其他相關(guān)細(xì)胞或組織的體外模型。
d)體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)：
注4：當(dāng)不能表征試驗(yàn)材料或不能采用在a)、b)和c)中規(guī)定的方法獲取的信息進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)是適用的。
e)根據(jù)ISO 14155和人體臨床研究的倫理原則，不應(yīng)在通過a)～d)中所述的一項(xiàng)或多項(xiàng)評(píng)價(jià)確定器械的潛在刺激性之前進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
5試驗(yàn)前的考慮
5.1總體要求
需要強(qiáng)調(diào)的是試驗(yàn)前的考慮是非常重要的，其能夠得出無需進(jìn)行刺激試驗(yàn)的結(jié)論。例如，若試驗(yàn)樣品pH≤2.0或≥11.5，此材料應(yīng)被認(rèn)為是刺激物，根據(jù)OECD 404不應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的刺激試驗(yàn)。
GB/T 16886.1—2022第5章規(guī)定的醫(yī)療器械分類要求和下列要求是適用的。
非無菌樣品應(yīng)僅通過局部試驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)研究，因?yàn)樵囼?yàn)樣品微生物污染的可能性會(huì)干擾最終試驗(yàn)解釋。對(duì)不能保證無菌但仍認(rèn)為是無污染的試驗(yàn)樣品，則應(yīng)論證皮內(nèi)應(yīng)用是合理的。
5.2材料類型
5.2.1基本考慮
應(yīng)考慮在醫(yī)療器械制造和裝配期間可能用作加工助劑的其他化學(xué)成分，例如，潤滑劑或脫模劑。除了原材料和制造加工助劑的化學(xué)成分外，裝配黏合劑/溶劑殘留物以及滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物可能存在于終產(chǎn)品中。這些成分是否產(chǎn)生健康危險(xiǎn)/風(fēng)險(xiǎn)取決于終產(chǎn)品的可瀝濾或降解性能，應(yīng)考慮這些成分潛在的刺激活性。以下類型材料經(jīng)常用于醫(yī)療器械并可引入刺激風(fēng)險(xiǎn)。
5.2.2陶瓷、金屬和合金
就化學(xué)成分的數(shù)量而言，這些材料通常不如聚合物和生物衍生材料復(fù)雜。
5.2.3聚合物
這類材料化學(xué)成分通常比陶瓷、金屬和合金更復(fù)雜，可能有若干反應(yīng)性產(chǎn)物/雜質(zhì)/添加劑，而且聚合反應(yīng)的完全程度可能會(huì)有不同。
5.2.4生物衍生材料
這類材料在其成分方面本身就很復(fù)雜，也常含有加工殘留物，如交聯(lián)劑和抗生素。生物材料的不同樣品之間的成分可能是不一致的。
5.3化學(xué)組成方面的信息
5.3.1 總體要求
應(yīng)根據(jù)ISO 10993-18對(duì)醫(yī)療器械化學(xué)成分進(jìn)行描述。如ISO 10993-1所述，所需的物理和/或化學(xué)表征程度取決于對(duì)材料配方的了解程度以及人體與醫(yī)療器械接觸的性質(zhì)和時(shí)間。至少，表征應(yīng)涉及醫(yī)療器械的組成化學(xué)物質(zhì)以及制造過程中可能殘留的過程助劑或添加劑。化學(xué)成分表征所需的嚴(yán)格程度主要取決于接觸的性質(zhì)、程度、頻率和持續(xù)時(shí)間以及識(shí)別的醫(yī)療器械或材料的危險(xiǎn)。在與生物安全有關(guān)的情況下，還應(yīng)獲得定量數(shù)據(jù)。如果無法獲得定量數(shù)據(jù)，應(yīng)論證并記錄其合理性。
5.3.2現(xiàn)有的數(shù)據(jù)來源
可能的情況下應(yīng)從原材料供應(yīng)商處索取化學(xué)組成方面的定性與定量信息。聚合物常要求專利信息的使用權(quán)，宜簽署轉(zhuǎn)讓和使用這種機(jī)密信息的條款。
還應(yīng)從產(chǎn)品制造的制造鏈的適宜成員中(包括半成品和零件制造商)索取其他任何生產(chǎn)過程中的添加劑(如脫模劑)的定性信息。
在沒有任何化學(xué)組成數(shù)據(jù)的情況下，建議研究文獻(xiàn)以確定原材料和任何添加劑的可能特性，這樣有助于選擇相關(guān)材料最適宜的分析方法。
應(yīng)按照ISO 10993-18進(jìn)行醫(yī)療器械的化學(xué)表征。
注：依據(jù)ISO或美國試驗(yàn)材料協(xié)會(huì)(ASTM)標(biāo)準(zhǔn)和/或用戶的要求能規(guī)定陶瓷、金屬和合金的成分，但為了獲取完整的成分定性與定量資料，可能還需要要求原材料供應(yīng)商或制造廠以及零件制造廠提供這些信息，以保證還能鑒別加工助劑。監(jiān)管機(jī)構(gòu)持有的材料主文檔是另一個(gè)可訪問的數(shù)據(jù)來源。
6體外刺激試驗(yàn)
6.1總則
用于測試刺激性的體外RhE模型是專為檢測純化學(xué)物皮膚刺激性而研發(fā)的(見OECD 439)。此方法被調(diào)整后采用兩種RhE模型進(jìn)行驗(yàn)證，用于檢測醫(yī)療器械浸提液中刺激性化學(xué)物質(zhì)。在檢測一些高分子醫(yī)用材料(PVC和硅樹脂)浸提液中的低濃度強(qiáng)刺激性化合物時(shí)，本方法與人斑貼試驗(yàn)和兔皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)相比同樣敏感。因此，本文件描述的RhE試驗(yàn)?zāi)芴娲ㄟ^皮膚和皮內(nèi)(皮膚內(nèi))接觸的體內(nèi)兔刺激試驗(yàn)。
注：提供有關(guān)正在測試的特定醫(yī)療器械的RhE模型適用性的詳細(xì)信息可能是相關(guān)的。
6.2體外重建人表皮模型
6.2.1試驗(yàn)系統(tǒng)——重建人類表皮模型
RhE模型應(yīng)含有正常人源表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，這種細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)可形成多層高度分化的人表皮模型。它應(yīng)包括具有組織構(gòu)造的基底層、棘層、顆粒層及與體內(nèi)類似的包含細(xì)胞間層狀脂質(zhì)層的多層角質(zhì)層。從健康志愿者獲取的正常人角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)在薄膜或?yàn)V紙上的氣液交界面培養(yǎng)數(shù)日，以形成包括主基底層、基底上層、棘層和顆粒層以及有功能的角質(zhì)層在內(nèi)的三維表皮模型。此模型系統(tǒng)應(yīng)允許極性(如生理鹽水)和非極性(如芝麻油)浸提液直接加至RhE模型的上表面。
不適合浸提的材料(如液體、凝膠、糊劑和顆粒)可能適用于此試驗(yàn)系統(tǒng)。如果使用，宜在測試前提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)，以證明該方法檢測這些材料形式的刺激活性的能力。
6.2.2試驗(yàn)原則
終點(diǎn)：細(xì)胞活性的測定基于3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)的細(xì)胞還原反應(yīng)及后續(xù)紫色甲臜鹽的轉(zhuǎn)化，之后再將甲臜從組織中萃取出來后進(jìn)行定量測定。處理組織的細(xì)胞活性以陰性介質(zhì)對(duì)照的百分比表示，以活性百分比的減少預(yù)測刺激的可能性。
注1：組織存活的減少可能伴隨IL-1α的釋放。能收集接觸組織培養(yǎng)基≤-20℃冰凍保存用于可能的細(xì)胞因子分析。
簡要步驟：對(duì)專門制作的含有低濃度刺激化學(xué)物的聚合物生物材料進(jìn)行的研究表明，與OECD 439純化學(xué)物方案相比需延長接觸時(shí)間。在37℃接觸生物材料浸提液中潛在的低濃度刺激物培養(yǎng)不少于18h～24h的時(shí)間，足以通過組織活性降低50%以上預(yù)測體外刺激性。在采用醫(yī)療器械沒提液進(jìn)行的評(píng)估RhE模型的比對(duì)試驗(yàn)中，18h和24h接觸得到了相似的結(jié)果。
加入試驗(yàn)和對(duì)照浸提液后的組織在37℃，5% CO2的濕化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
通過杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)或不含Ca2+、Mg2+的PBS沖洗以終止試驗(yàn)樣品浸提液的接觸。沖洗后將RhE組織表面吸干。將組織與MTT溶液在24孔板中(1 mg/mL，300μL/孔)培養(yǎng)3h后評(píng)估活性。室溫條件下采用適量(取決于采用的RhE模型)異丙醇萃取甲臜結(jié)晶至少2h。從每塊RhE組織萃取的甲臜中取2份或3份(根據(jù)說明書)加入96孔板(200μL/孔)后測定570nm處的吸光度。
對(duì)直接接觸試驗(yàn)，分別用體積分?jǐn)?shù)1%的溶于0.9%氯化鈉注射液的十二烷基硫酸鈉(SDS，見6.4.4)溶液作陽性對(duì)照(PCs)，DPBS或不含Ca2+、Mg2+的PBS處理的表皮作陰性對(duì)照。對(duì)于浸提液試驗(yàn)，添加經(jīng)驗(yàn)證為刺激物質(zhì)的對(duì)照在芝麻油和0.9%氯化鈉注射液浸提后能用作陽性對(duì)照。
注2：收集18h或24h接觸后的組織培養(yǎng)基能冰凍保存(至少-20℃)以備作為細(xì)胞活性補(bǔ)充測定終點(diǎn)的細(xì)胞因子(IL-1α)測定。除細(xì)胞活性MTT試驗(yàn)間接確定的細(xì)胞損傷成分：IL-1α測定確定皮膚刺激評(píng)估中的炎癥成分。
介質(zhì)對(duì)照應(yīng)包括已進(jìn)行了ISO 10993-12醫(yī)療器械浸提程序的生理鹽水(NaC1，0.9%)溶液和芝麻油，每一處理組織的活性以陰性DPBS或PBS處理的對(duì)照組織的百分比表示(均值)。
本方法的已知局限性：不適用于氣體或氣溶膠，也不適用于評(píng)價(jià)固體材料直接接觸的刺激性，因?yàn)椴荒鼙ＷC整個(gè)試驗(yàn)表面緊密接觸。
已知需要特殊對(duì)照的試驗(yàn)化合物的情況：某些化學(xué)物能直接還原MTT試劑(如親電子試劑、高pH試驗(yàn)樣品)，還有化學(xué)物能直接將組織或細(xì)胞染色。只有在接觸過程結(jié)束時(shí)組織上仍有足量的化學(xué)物質(zhì)時(shí)，這些試驗(yàn)樣品特性才能產(chǎn)生干擾。在這些情況下，宜應(yīng)用特殊程序以定量MTT“真正”的還原。參考文獻(xiàn)[23]和[24]給出了測試可能與MTT相互作用的方案。使用特殊或適合的對(duì)照，在減去因直接化學(xué)性MTT還原和/或組織中浸提出的化學(xué)物殘留顏色導(dǎo)致的非特異性光密度(OD)值后，能計(jì)算出真正的組織活性。
6.2.3預(yù)測模型
此預(yù)測模型是基于OECD 439預(yù)測模型和在優(yōu)化醫(yī)療器械方案過程中進(jìn)一步獲得的數(shù)據(jù)。
如果接觸后細(xì)胞活性≤50%：試驗(yàn)樣品為刺激物(1)。
如果接觸后細(xì)胞活性>50%：試驗(yàn)樣品為非刺激物(NI)。
應(yīng)對(duì)極性(如生理鹽水)及非極性(如芝麻油)試驗(yàn)浸提液進(jìn)行細(xì)胞活性試驗(yàn)。如果至少一種浸提液顯示出陽性結(jié)果(活性≤50%)，那么認(rèn)為此醫(yī)療器械樣品有潛在的刺激性，然后應(yīng)考慮該器械或器械組件會(huì)引起刺激反應(yīng)。必要時(shí)，可考慮進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)刺激反應(yīng)的類型。若兩種浸提液結(jié)果均為非刺激物(活性>50%)，應(yīng)認(rèn)為器械或器械組件為非刺激物。
6.3材料
6.3.1重建人類表皮模型——產(chǎn)品說明
表皮細(xì)胞取自HIV1、2抗體，丙型肝炎抗體、乙肝抗原均陰性的健康志愿者。盡管如此，宜按照生物材料的常規(guī)處理程序。
對(duì)基于醫(yī)療器械浸提液的試驗(yàn)樣品，在一項(xiàng)大型國際比對(duì)試驗(yàn)中評(píng)價(jià)了OECD 439中描述和驗(yàn)證的兩種RhE模型的應(yīng)用。在這個(gè)試驗(yàn)中使用了EpiDermTM組織EPI-2001)模型和SkinEthicTMRhE模型2)。已制定這些模型的具體方案作為補(bǔ)充材料。
這兩個(gè)模型均已被歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)驗(yàn)證用于測定化學(xué)物皮膚刺激并被OECD 439和歐盟(EU)導(dǎo)則B.46收錄。出于分類和標(biāo)識(shí)的目的，這些模型已用純工業(yè)化學(xué)物進(jìn)行了驗(yàn)證。如果經(jīng)過醫(yī)療器械浸提液皮膚和組織刺激試驗(yàn)驗(yàn)證，OECD 439中描述和驗(yàn)證的其他模型也能用于醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗(yàn)。
一個(gè)新的用于體外皮膚刺激性試驗(yàn)的RhE模型若要列入OECD 439，應(yīng)證明其預(yù)測能力和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)及實(shí)驗(yàn)室間變異性與最初的比對(duì)試驗(yàn)有等同的表現(xiàn)。需對(duì)一組與最初比對(duì)試驗(yàn)相同的刺激及非刺激材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間(至少3個(gè)實(shí)驗(yàn)室)的3輪(3個(gè)生產(chǎn)批號(hào)的RhE模型)盲法試驗(yàn)。
6.3.2醫(yī)療器械浸提液制備
應(yīng)按照ISO 10993-12制備醫(yī)療器械和/或生物材料浸提液。
——極性沒提液應(yīng)在0.9%生理鹽水中制備(900mg加入100mL超純水或去離子水)。
——非極性浸提液應(yīng)在芝麻油中制備(可接受的質(zhì)量實(shí)例：超精煉和醫(yī)藥級(jí))。
注1：在比對(duì)試驗(yàn)中證明0.9%氯化鈉注射液和芝麻油是用于體外RhE刺激試驗(yàn)的PVC和/或硅樹脂聚合物中的刺激物的適宜沒提劑。因此，推薦以上浸提介質(zhì)。
1) EpiDermTM是由MatTek體外生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室(布拉迪斯拉發(fā)：斯洛伐克)和MarTek公司(阿什蘭，馬里蘭州，美國)提供的產(chǎn)品的商標(biāo)。給出這一信息是為了方便本文件的使用者，并不代表對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可以使用這些等效產(chǎn)品。
2) SkinEticTMRHE是由EpiSkin SA(里昂，法國)、EpiSkin Brazil里約熱內(nèi)盧，巴西)和Shanghai EpiSkin Biotech-nology(上海，中國)共同提供的產(chǎn)品的商標(biāo)。給出這一信息是為了方便本文件的使用者，并不代表對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可以使用這些等效產(chǎn)品。
若使用其他浸提介質(zhì)進(jìn)行浸提，應(yīng)提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)，以確認(rèn)浸提介質(zhì)的變化不會(huì)影響試驗(yàn)系統(tǒng)區(qū)分陰性、弱、中、強(qiáng)刺激物的能力。
宜基于ISO 10993-12論證浸提時(shí)間和溫度。
注2：在評(píng)價(jià)RhE用于醫(yī)療器械試驗(yàn)液刺激試驗(yàn)的比對(duì)試驗(yàn)中，使用了加標(biāo)(spiked)聚合物(PVC和硅樹脂)，在(37±1)℃振蕩/振搖(72±2)h進(jìn)行的浸提。
不適合浸提的材料(如液體、凝膠、糊劑和顆粒)可能適用于此試驗(yàn)系統(tǒng)。如果使用，宜在測試前提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)，以證明該方法檢測這些材料形式的刺激活性的能力。
6.4 方法
6.4.1總則
警告——本文件描述的操作步驟要求使用危險(xiǎn)試劑。本文件不聲稱涵蓋所有相關(guān)的安全問題。本文件的使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防和職業(yè)健康與安全措施，并確保遵守法規(guī)和法規(guī)要求。
MTT具有以下危險(xiǎn)：
——H302：吞咽有害；
——H315：引起皮膚刺激；
——H319：引起嚴(yán)重眼刺激；
——H330：吸入致命；
——H335：可引起呼吸道刺激；
——H341：懷疑會(huì)導(dǎo)致遺傳性缺陷(說明接觸途徑——如已確證無其他接觸途徑造成這一危險(xiǎn))。
異內(nèi)醇具有以下危險(xiǎn)：
——H225：高度易燃液體和蒸氣；
——H319：引起嚴(yán)重眼刺激；
——H336：可引起昏睡或眩暈。
6.4.2試驗(yàn)步驟
附錄B提供了使用重建人類表皮(RhE)模型進(jìn)行體外刺激試驗(yàn)的清單。
應(yīng)記錄RhE刺激試驗(yàn)過程中所有操作。附錄C提供了方法記錄單(MDS)舉例。以下是進(jìn)行體外皮膚刺激試驗(yàn)的不同步驟的描述。應(yīng)遵循以下步驟，對(duì)任何偏差進(jìn)行驗(yàn)證并提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)。
——RhE組織到達(dá)前開始制備器械/生物材料試驗(yàn)樣品的極性(生理鹽水)和非極性(芝麻油)浸提液。浸提開始時(shí)間宜基于按照ISO 10993-12選擇的浸提時(shí)間和組織準(zhǔn)備好進(jìn)行處理的時(shí)間(取決于RhE組織到達(dá)和必需的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間)。試驗(yàn)材料/醫(yī)療器械浸提液宜在ISO 10993-12允許的時(shí)間范圍內(nèi)使用，以便將浸提液用于生物相容性試驗(yàn)。浸提過程中持續(xù)振蕩/振搖。
——收到RhE組織后，即將RhE組織從運(yùn)輸板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至組織制造商要求使用的培養(yǎng)基中。如果組織制造商的說明中有要求，將組織放入大小合適的培養(yǎng)板中用培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)(見6.5.2)。
——如果不包括陽性對(duì)照材料的沒提，在試驗(yàn)當(dāng)天將陽性對(duì)照(SDS)按規(guī)定的濃度注入極性(生理鹽水)溶劑中。在證明適宜性和陽性結(jié)果后，能使用較低濃度的SDS(如0.25%～0.5%)作為陽性對(duì)照。
入在組織表面分別加上100μL陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、介質(zhì)對(duì)照和試驗(yàn)樣品。
——在(37±1)℃、(5±1)% CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(18±1)h或(24±2)h。
注：比對(duì)試驗(yàn)中EpiDermTM組織(EPI-200)培養(yǎng)時(shí)間是18 h，SkinEthicTMRhE模型是24h。接觸18h或24h兩種模型顯示了相似的試驗(yàn)結(jié)果
——通過DPBS或不含Ca2+、Mg2+的PBS沖洗以終止接觸。沖洗后按照組織制造商說明除去組織多余水分。
——轉(zhuǎn)移組織至MTT溶液(可選擇：采集培養(yǎng)基以各白介素釋放測定，≤-20℃冰箱保存樣本)。
——在MTT中培養(yǎng)組織3h±5 min[(37±1)℃，(5±1)% CO2，濕化培養(yǎng)箱中]。
——轉(zhuǎn)移并浸入甲臜萃取介質(zhì)異丙醇中。
——甲臜萃取：室溫至少2h或過夜(密封，室溫)。
——振搖并混勻。
——轉(zhuǎn)移甲臜溶液至96孔板。
——平板分光光度計(jì)讀取OD值。
6.4.3培養(yǎng)基和終點(diǎn)溶液
6.4.3.1 MTT溶液
MTT溶液對(duì)光敏感。使用錫箔紙或適宜材料避光保護(hù)。
用PBS溶解MTT粉末至終濃度5 mg/mL。0.22 μm濾膜過濾。在無菌深色1.5mL微量管中制備即用型溶液(如1mL等分試樣)。-20℃冰箱保存試劑。保存時(shí)間：-20℃下1年。
或者，也能使用RhE組織制造商制備的MTT溶液。
使用預(yù)熱的培養(yǎng)基稀釋MTT儲(chǔ)備液至終濃度1mg/mL。使用前避光保存(使用前儲(chǔ)存時(shí)間不超過2h)。
6.4.3.2 異丙醇溶液
使用未稀釋的2-內(nèi)醇原液(CAS號(hào)：67-63-0)。
6.4.4試驗(yàn)樣品和對(duì)照制備
記錄對(duì)照或試驗(yàn)浸提液的主要信息，包括代碼或數(shù)字、物理特性(如黏稠度)、體積或質(zhì)量、失效日期和儲(chǔ)存條件。記錄制備及方法細(xì)節(jié)。附錄C提供了制備記錄舉例。
陰性對(duì)照的具體步驟(DPBS或PBS)：陰性對(duì)照為DPBS或不含Ca2+、Mg2+的PBS。應(yīng)使用無菌即用型DPBS或PBS。若DPBS或PBS由10倍濃度或粉末制備需將pH調(diào)至7.0并將溶液滅菌。應(yīng)將3×100μL體積分別加入3塊單獨(dú)的RhE組織。
陽性對(duì)照的具體步驟(1%體積分?jǐn)?shù)SDS)：應(yīng)將500μL 20% SDS水溶液與9.5mL特定法提介質(zhì)(生理鹽水)徹底混勻。制備后，用適合的加樣器將100μL轉(zhuǎn)移并加至RhE組織上。在證明適宜性和陽性結(jié)果后，可使用較低濃度的SDS(如0.25%～0.5%)作為陽性對(duì)照。
應(yīng)在試驗(yàn)當(dāng)天每次使用前新鮮制備極性浸提介質(zhì)的陽性對(duì)照。
應(yīng)使用商品化的20% SDS溶液。
介質(zhì)對(duì)照的具體步驟：應(yīng)將介質(zhì)對(duì)照(0.9%生理鹽水和芝麻油)置于浸提容器(如琥珀色玻璃瓶)并進(jìn)行如在(37±1)℃、(72±2)h中與試驗(yàn)材料完全相同的浸提程序。如果直接將樣品接觸組織，這一步能省略。
陽性對(duì)照材料是很少的。日本食物及藥物安全中心的Hatano研究所提供的Y-4聚合物或其他已證實(shí)的適合的供應(yīng)商提供的對(duì)照(若經(jīng)驗(yàn)證)能用于體外RhE模型試驗(yàn)。若經(jīng)驗(yàn)證，硅樹脂-SDS能用作生理鹽水浸提液的陽性對(duì)照。
6.5試驗(yàn)的注意事項(xiàng)
6.5.1重建人表皮組織的接收
應(yīng)記錄試劑盒詳細(xì)信息及測試過程(如記錄于MDS)。
6.5.2準(zhǔn)備及預(yù)培養(yǎng)
按以下步驟進(jìn)行。
——如果RhE組織制造商的說明中有要求，將組織放入大小合適的培養(yǎng)板中用組織制造商要求的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)。
——根據(jù)RhE組織制造商的說明將合適數(shù)量的培養(yǎng)孔加入適量的新鮮培養(yǎng)基備用。
——無菌條件下，打開盛有RhE組織的培養(yǎng)板的蓋子。無菌氣流下拿開蓋子并小心(用無菌鑷子)拿出每個(gè)盛有RhE組織的小室。在無菌濾紙或紗布上輕輕吸去所有黏附在小室外側(cè)緣殘留瓊脂，然后將組織置于無菌的盛有新鮮培養(yǎng)基的孔中。
——肉眼檢查確認(rèn)無瓊脂殘留，轉(zhuǎn)移組織至新鮮培養(yǎng)基，傾斜小室避免底部氣泡形成。
注：用于運(yùn)輸?shù)?4孔板能在室溫密封保存/儲(chǔ)存，以便在1周后觀察有無可能的污染跡象。
——檢查RhE組織質(zhì)量并記錄組織變化。
——根據(jù)制造商的使用說明將盛有RhE組織的小室轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中。根據(jù)制造商使用要求預(yù)培養(yǎng)[(37±1)℃、(5±1)%CO2的濕化培養(yǎng)箱中]組織備用。
6.6加樣和沖洗
6.6.1總則
雖然使用所有模型進(jìn)行的體外皮膚刺激試驗(yàn)都遵循相同的原則，但宜注意在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，具體模型間可能存在小的差異。
如果標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)適用于特定RhE模型，宜遵從制造商SOP，并考慮本文件中的醫(yī)療器械浸提液試驗(yàn)中特殊方面(如接觸時(shí)間)。在使用OECD 439引用的某一RhE模型進(jìn)行醫(yī)療器械浸提液和/或醫(yī)療器械進(jìn)行試驗(yàn)之前，應(yīng)證明此特定模型的適用性，當(dāng)用于醫(yī)療器械系統(tǒng)時(shí)，這些商業(yè)的或優(yōu)化的使用說明宜產(chǎn)生與本文件中包含的已驗(yàn)證方法等效的結(jié)果。
6.6.2準(zhǔn)備
按以下步驟進(jìn)行。
——室溫預(yù)熱維持培養(yǎng)基。
——加樣前約5min從培養(yǎng)箱中拿出預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)板。
——加樣前準(zhǔn)備。
●準(zhǔn)備合適大小的培養(yǎng)板用于RhE模型與試驗(yàn)樣品和對(duì)照一起培養(yǎng)。
●用試驗(yàn)材料代碼標(biāo)記培養(yǎng)板蓋子；每個(gè)樣品和對(duì)照3塊組織/孔。
●更換小室下的培養(yǎng)基(加入適量的培養(yǎng)其)或?qū)⑿∈乙迫牒迈r培養(yǎng)其的新板中。
6.6.3試驗(yàn)浸提液及對(duì)照的接觸
按以下步驟進(jìn)行。
——吸取(100±2)μL(即200μL/cm2)未稀釋的樣品試驗(yàn)液(即醫(yī)療器械浸提液)、VCs、NCs或PCs置于各自3個(gè)單獨(dú)組織的表面。用移液器吸頭輕輕地將樣品試驗(yàn)液鋪在RhE組織表面。因沖洗順序要與加樣順序相同，所以加樣順序非常重要。
注1：模型表面是疏水的，所以確保100μL均勻涂布在RhE組織的整個(gè)表面。由于表面張力機(jī)制，有時(shí)極性溶劑微滴只能分布至RhE組織的外緣。這種情況下，能使用移液器吸頭鋪開樣品或使用鑷子敲擊小室使樣品覆蓋整個(gè)RhE組織的表面。另外，對(duì)于油性浸提液，能使用頭端球狀的玻璃移液器(Pastcur)鋪開試驗(yàn)樣品以保證其與整個(gè)RhE組織的表面的正確接觸。
——加樣后的組織放在層流凈化罩內(nèi)，直至最后一塊組織加樣完成。
——所有組織加樣完成后，轉(zhuǎn)移所有培養(yǎng)板至濕化培養(yǎng)箱[(37±1)℃、(5±1% CO2]培養(yǎng)至所需時(shí)間。
注2：比對(duì)試驗(yàn)中EpiDermTM華組織(EPI-200)培養(yǎng)時(shí)間是(18±1)h，SkinEthicTMRhE模型是(24±2)h。
——接觸完成后，使用滅菌DPBS或PBS徹底沖洗組織，加滿再清空小室數(shù)次以去除殘留試驗(yàn)材料，推薦沖洗15次～25次。若RhE模型制造商提供具體說明則遵照?qǐng)?zhí)行。沖洗不宜太輕柔，否則試驗(yàn)樣品不能完全清除。
——沖洗后，反扣小室輕輕振動(dòng)去掉殘留DPBS或PBS，在無菌吸水紙上反扣小室排干水分。
——將組織表面吸干(如使用雙頭棉簽)。
——轉(zhuǎn)移小室至適宜容器或預(yù)先加有新鮮測試培養(yǎng)基的(0.3 mL/孔)組織培養(yǎng)板中，直至沖洗完所有組織、準(zhǔn)備進(jìn)行MTT培養(yǎng)。
若發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)樣品仍有殘存在RhE組織表面的跡象，試著使用無菌濕棉棒去除。記錄該過程。可在解剖鏡下肉眼評(píng)價(jià)組織表面。
注 3：評(píng)價(jià)RhE組織活性前能收集小室下培養(yǎng)基進(jìn)行額外的細(xì)胞因子測定，存活組織的減少公伴隨IL-1α的釋放。
6.7用于測定接觸階段后RhE組織活性的MTT試驗(yàn)
6.7.1MTT 培養(yǎng)和異丙醇萃取
通過MTT 還原測定法評(píng)估RhE組織活性。接觸結(jié)束后立即進(jìn)行MTT測試。沖洗組織去除殘留試驗(yàn)樣品。
應(yīng)在開始沖洗步驟前準(zhǔn)備MTT溶液并提前加入24孔培養(yǎng)板中(300μL/孔)。
——準(zhǔn)備MTT 培養(yǎng)其和加有測試培養(yǎng)基的24孔板或其他合適的培養(yǎng)板。將300μL MTT 培養(yǎng)基(濃度為1mg/mL)加入所需數(shù)量的24孔板的各孔中。
——從臨時(shí)存儲(chǔ)板中移出小室，按在無菌吸水紙或使用無菌棉簽弄干小室底部，然后轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入300 μL MTT的24孔板中。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱[(37±1)℃、(5±1)% CO2的濕化培養(yǎng)箱中]，在記錄單(如在MDS中)上記錄MTT培養(yǎng)開始時(shí)間，培養(yǎng)3h±5 min。
——MTT培養(yǎng)完成后，吸干小室中所有殘留MTT溶液，根據(jù)RhE供應(yīng)商說明書轉(zhuǎn)移組織至合適的盛有適量異內(nèi)醇的組織培養(yǎng)板中。
——密封容器或平板，或置于密封塑料袋中防止蒸發(fā)。記錄萃取開始時(shí)間(如在MDS中)，用平板振蕩器以約120r/min的速率室溫輕輕振蕩萃取甲臜至少2h。也可選擇過夜萃取(18h～24h)，上述密封平板不振蕩條件下室溫或冰箱內(nèi)避光萃取。分析萃取液前，在平板振蕩器振蕩至少15 min。
——培養(yǎng)后，使用槍頭成20G注射針刺破組織和膜以得到相應(yīng)孔中的所有萃取液。得到溶有甲臜的溶液測吸光度。轉(zhuǎn)移萃取液至96孔板前用加樣器至少上下吹打3次至溶液均勻。
